PCR, jẹ iṣesi pq polymerase, eyiti o tọka si afikun ti dNTP, Mg2 +, awọn ifosiwewe elongation ati awọn ifosiwewe imudara imudara si eto labẹ catalysis ti DNA polymerase, lilo DNA obi bi awoṣe ati awọn alakoko pato bi aaye ibẹrẹ ti itẹsiwaju, Nipasẹ awọn igbesẹ ti denaturation, annealing, itẹsiwaju, ati be be lo, awọn ilana ti in vitro replicating ọmọbinrin okun DNA tobaramu si awọn obi okun awoṣe DNA le ni kiakia ati ni pato amplify eyikeyi afojusun DNA ni fitiro.
1. Gbona Bẹrẹ PCR
Akoko ibẹrẹ ti imudara ni PCR aṣa kii ṣe lati fi ẹrọ PCR sinu ẹrọ PCR, lẹhinna eto naa bẹrẹ lati pọ si.Nigbati iṣeto eto ba ti pari, imudara naa bẹrẹ, eyiti o le fa imudara ti kii ṣe pato, ati PCR-ibẹrẹ le yanju iṣoro yii.
Kini PCR ti o gbona?Lẹhin ti a ti pese eto ifarabalẹ, iyipada henensiamu ti tu silẹ ni iwọn otutu giga (nigbagbogbo ti o ga ju 90 ° C) lakoko ipele alapapo ibẹrẹ ti iṣesi tabi ipele “ibẹrẹ gbona”, ki DNA polymerase ti mu ṣiṣẹ.Akoko imuṣiṣẹ deede ati iwọn otutu da lori iseda ti DNA polymerase ati oluyipada ibẹrẹ-gbigbona.Ọna yii ni akọkọ nlo awọn iyipada gẹgẹbi awọn aporo-ara, awọn ligands ijora, tabi awọn iyipada kemikali lati ṣe idiwọ iṣẹ ṣiṣe ti DNA polymerase.Niwọn igba ti iṣẹ ṣiṣe ti DNA polymerase ti ni idinamọ ni iwọn otutu yara, imọ-ẹrọ ibẹrẹ gbona n pese irọrun nla fun murasilẹ ọpọlọpọ awọn eto ifaseyin PCR ni iwọn otutu yara laisi irubọ pato ti awọn aati PCR.
2. RT-PCR
RT-PCR (Iyipada transcription PCR) jẹ ilana idanwo fun yiyipada transcription lati mRNA sinu cDNA ati lilo bi awoṣe fun imudara.Ilana adanwo ni lati yọ RNA lapapọ kuro ninu awọn sẹẹli tabi awọn sẹẹli ni akọkọ, lo Oligo (dT) bi alakoko, lo transscriptase yiyipada lati ṣajọpọ cDNA, ati lẹhinna lo cDNA gẹgẹbi awoṣe fun imudara PCR lati gba jiini ibi-afẹde tabi rii ikosile pupọ.
3. Fluorisenti pipo PCR
PCR pipo Fuluorisenti (PCR Quantitative-akoko gidi,RT-qPCR) tọka si ọna ti fifi awọn ẹgbẹ Fuluorisenti kun si eto ifaseyin PCR, ni lilo ikojọpọ awọn ifihan agbara Fuluorisenti lati ṣe atẹle gbogbo ilana PCR ni akoko gidi, ati nikẹhin lilo iṣiwọn boṣewa lati ṣe itupalẹ awoṣe ni iwọn.Awọn ọna qPCR ti o wọpọ pẹlu SYBR Green I ati TaqMan.
4. itẹ-ẹiyẹ PCR
PCR itẹ-ẹiyẹ tọka si lilo awọn eto meji ti awọn alakoko PCR fun awọn iyipo meji ti imudara PCR, ati ọja imudara ti iyipo keji jẹ ajẹku jiini ibi-afẹde.
Ti aiṣedeede ti bata akọkọ ti awọn alakoko (awọn alakoko ita) fa ọja ti kii ṣe kan pato lati pọ si, o ṣeeṣe ti agbegbe kanna ti kii ṣe pato ni idanimọ nipasẹ bata meji ti alakoko ati tẹsiwaju lati pọ si jẹ kekere, nitorinaa imudara nipasẹ bata meji ti awọn alakoko, pato ti PCR ti ni ilọsiwaju.Anfani kan ti ṣiṣe awọn iyipo meji ti PCR ni pe o ṣe iranlọwọ lati mu ọja to pọ si lati ibẹrẹ DNA to lopin.
5. Touchdown PCR
PCR Touchdown jẹ ọna lati mu ilọsiwaju pato ti iṣesi PCR ṣiṣẹ nipa ṣiṣatunṣe awọn ipilẹ ọmọ PCR.
Ni ifọwọkan PCR, iwọn otutu annealing fun awọn akoko diẹ akọkọ ti ṣeto awọn iwọn diẹ loke iwọn otutu annealing ti o pọju (Tm) ti awọn alakoko.Iwọn otutu mimu ti o ga julọ le dinku imunadoko ti kii ṣe pato, ṣugbọn ni akoko kanna, iwọn otutu annealing ti o ga julọ yoo mu iyapa ti awọn alakoko ati awọn ilana ibi-afẹde pọ si, ti o mu abajade PCR dinku.Nitoribẹẹ, ni awọn akoko diẹ akọkọ, iwọn otutu annealing nigbagbogbo ṣeto lati dinku nipasẹ 1°C fun ọmọ kan lati mu akoonu ti jiini ibi-afẹde ninu eto naa pọ si.Nigbati iwọn otutu annealing ba dinku si iwọn otutu to dara julọ, iwọn otutu annealing ti wa ni itọju fun awọn iyipo to ku.
6. PCR taara
PCR Taara n tọka si imudara ti DNA afojusun taara lati inu ayẹwo laisi iwulo fun ipinya acid nucleic ati isọdọmọ.
Awọn oriṣi meji ti PCR taara wa:
ọna taara: mu iwọn kekere ti ayẹwo ati ṣafikun taara si PCR Master Mix fun idanimọ PCR;
ọna fifọ: lẹhin ti o ṣe ayẹwo ayẹwo, fi sii si lysate, lyse lati tu jiini silẹ, mu iwọn kekere ti lysed supernatant ki o si fi sii PCR Master Mix, ṣe idanimọ PCR.Ọna yii jẹ irọrun ṣiṣiṣẹ adaṣe adaṣe, dinku akoko-ọwọ, ati yago fun ipadanu DNA lakoko awọn igbesẹ mimọ.
7. SOE PCR
Gene splicing nipasẹ agbekọja PCR (SOE PCR) nlo awọn alakoko pẹlu awọn ipari ibaramu lati jẹ ki awọn ọja PCR ṣe awọn ẹwọn agbekọja, nitorinaa ni ifasẹyin imudara ti o tẹle, nipasẹ itẹsiwaju ti awọn ẹwọn agbekọja, awọn orisun oriṣiriṣi ti ilana kan ninu eyiti awọn ajẹkù ti o pọ si ti wa ni agbekọja. o si pin papọ.Imọ ọna ẹrọ lọwọlọwọ ni awọn itọnisọna ohun elo akọkọ meji: ikole ti awọn Jiini idapọ;iyipada ti o darí aaye-jiini.
8. IPCR
PCR inverse (IPCR) nlo awọn alakoko ibaramu yiyipada lati mu awọn ajẹkù DNA pọ si yatọ si awọn alakoko meji, ati ki o pọ si awọn ilana aimọ ni ẹgbẹ mejeeji ti ajẹku DNA ti a mọ.
IPCR ni akọkọ ti a ṣe lati pinnu ilana ti awọn agbegbe aimọ ti o wa nitosi, ati pe a lo pupọ julọ lati ṣe iwadi awọn ilana olupolowo pupọ;awọn atunto chromosomal oncogenic, gẹgẹbi idapọ pupọ, gbigbe ati gbigbe;ati iṣọpọ apilẹṣẹ gbogun ti, ni a tun lo ni bayi Fun mutagenesis ti o da lori aaye, daakọ plasmid kan pẹlu iyipada ti o fẹ.
9. dPCR
PCR oni-nọmba (dPCR) jẹ ilana kan fun titobi pipe ti awọn ohun elo acid nucleic.
Lọwọlọwọ awọn ọna mẹta wa fun titobi awọn ohun elo acid nucleic.Photometry da lori gbigba ti awọn ohun elo acid nucleic;PCR pipo Fuluorisenti gidi-akoko (Real Time PCR) da lori iye Ct, ati pe iye Ct tọka si nọmba ọmọ ti o baamu si iye fluorescence ti o le rii;PCR oni-nọmba jẹ imọ-ẹrọ pipo tuntun ti o da lori ọna PCR-molecule ẹyọkan fun kika iṣiro acid nucleic jẹ ọna pipo pipe.
Akoko ifiweranṣẹ: Jun-13-2023